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2020版药典中新增的多维液相色谱究竟是“何方神圣”?
点击次数:134 发布时间:2019-09-25 打印本页面 返回

2020版药典高效液相色谱法中新增了多维液相色谱,各位不了解的小伙伴快来看看吧

 

一维液相色谱的劣势

色谱作为复杂混合物的分离工具,对化合物的分离分析发挥了很大的作用。目前使用的大多数仪器为一维色谱,使用一根柱子,适合于含几十至几百个物质的样品分析。当样品更复杂时,例如有人分析鹿茸蛋白,得到上千个色谱峰,可是经质谱定性表明,平均每个峰又含有二个组分,就要用到多维色谱技术。

 

多维液相色谱的优势

多维液相色谱又称为色谱/色谱联用技术,是采用匹配的接口将不同分离性能或特点的色谱连接起来,di一级色谱中未分离或需要分离富集的组分由接口转移到第二级色谱中,第二级色谱仍需进一步分离或分离富集的组分,也可以继续通过接口转移到第三级色谱中。

 

理论上,可以通过接口将任意级色谱串联或并联起来,直至将混合物样品中所有的难分离、需富集的组分都分离或富集之。但实际上,一般只要选用两个合适的色谱联用就可以满足绝大多数难分离混合物样品的分离或富集要求。因此,一般的色谱/色谱联用都是二级,即二维色谱。

图1、二维液相色谱示意图

 

二维液相色谱分类

在二维色谱的术语中,1D和2D分别指一维和二维;而¹D和²D则分别代表di一维和第二维。

 

二维液相色谱可以分为差异显著的两种类型。若两种色谱的联用仅是通过接口将前一级色谱中某一些组分传递到后一级色谱中继续分离,这是中心切割式二维色谱(heart-cuttingmode two-dimensional chromatography),一般用(LC-LC)表示。当两种色谱联用,接口将前一级色谱中的全部组分连续地传递到后一级色谱中进行分离,这种二维色谱称为全二维色谱(comprehensive two-dimensional chromatograghy)一般用LC×LC表示。

 

LC×LC是将¹D色谱柱的流出物连续转移至²D色谱柱。相比之下,LC-LC则是将¹D流出物选择性地(部分地)转移至²D色谱柱中。此外,这两种类型下还有若干子类,包括选择性二维色谱(sLC×LC)和多中心切割²D-LC(mLC-LC)。

 

LC-LC或LC×LC两种二维色谱可以是相同的分离模式和类型,也可以是不同的分离模式和类型。接口技术是实现二维色谱分离的关键之一,原则上,只要有匹配的接口,任何模式和类型的色谱都可以联用。

 

和一维色谱一样,二维色谱也可以和质谱、红外和核磁共振等联用。

 

SCX/RP二维液相色谱用于珠蛋白酶解产物分析

图2、 SCX/RP高通量分析珠蛋白酶解产物

 

di一维采用SCX强阳离子交换色谱柱,流动相A为5mM NaH2PO4+1%乙腈,B为A+1.0mol/L NH4Cl,流动相pH4.0。

 

第二维采用两支相同的C18常规反相色谱柱,流动相A为含0.1%TFA的水溶液,B为含0.1%TFA的乙腈。

 

样品进入阳离子交换色谱,由SCX流动相逐步增加盐浓度间断洗脱,通过接口的有效转移将SCX洗脱的产物导入第二维反相色谱中进一步分离。

 

在选定实验条件下的二维分析结果,在离子交换色谱和反相色谱构成的二维液相色谱系统中,因离子交换色谱较高的柱容量通常作为di一维系统,而反相色谱与离子交换色谱流动相有较好的兼容性及较高的分辨率常作为第二维系统。

 

由于SCX对样品的切割分离,二维分离的结果大大降低了样品分析的复杂性。同时由于二维分离机理的正交性,进一步拓宽了样品的分离空间,增强了系统的分离能力。在分析珠蛋白酶解产物中,di一维离子交换切割次数为19次,由图2可知第二维反相色谱峰容量为174,这种台阶式洗脱切割方法峰容量为di一维切割次数乘以第二维峰容量,因此SCX/RP二维液相色谱的峰容量可达到3306。

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