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色谱柱那么多,维护方式快拿走。ㄒ唬
点击次数:103 发布时间:2020-01-07 打印本页面 返回

 

之前给大家介绍了聚合物基质色谱柱的使用维护和注意事项。本文给大家继续介绍非反相色谱柱的维护再生及使用注意事项。

 

 

液相色谱柱在使用过程中,难免会出现污染,损耗等问题,这时就需要对色谱柱进行必要的冲洗维护。从使用的键合相来看,液相色谱柱大体可分为反相柱和非反相柱。对于反相键合相,如C18、C8、苯基等来说,由于其应用面较广,流动相组成复杂多变,因此对于这类色谱柱的维护很难有固定的思路和模式,大多数情况下都需要具体问题具体分析;而对于非反相填料和键合相,如硅胶、凝胶、氨基、氰基、离子交换来说,由于其使用的项目相对较为专一,或其流动相组成跨度不大,因此在遇到问题的处理方式上也有较为固定的思路可以遵循。

 

下面,小编就为大家整理一些非反相色谱柱的问题排查思路和常见维护方式。

 

G10

G-10为软凝胶填料,机械强度自然不如硅胶填料那么强,因此在使用过程中,应极力避免流动相或样品中含有有机溶剂,否则柱床极易塌陷。若使用一段时间后出现问题,如峰形和分离度下降,则可以按照说明书,用蒸馏水重新活化柱子,冲洗时间可以久一点,然后用流动相低流速平衡过夜;若无明显改善,则可按照说明书的再生冲洗方法进行冲洗,再生冲洗步骤见下文。

 

若以上操作均无明显改善,则zui有可能的情况下是填料出现严重污染,甚至是填料塌陷,此情况下再进行冲洗的意义不大,建议客户重新采购新的色谱柱。

 

G-10色谱柱再生冲洗:

1、0.5mol/L NaOH 和 0.5mol/L NaCl,1:1混合(v/v),冲洗20-30倍柱体积;

2、用蒸馏水冲洗色谱柱直至中性;

3、按照药典方法检测葡聚糖2000对照品系统适用性试验;

 

SEC

SEC填料为亲水球状蛋白硅胶,常用作高分子聚合物的分子量排阻分离。处理方式类似G-10,有问题了也是重新活化,用纯水冲洗长时间,然后流动相平衡;若无明显改善,就按照说明书上的异常冲洗方式冲洗,冲洗方式见下文。至于分离度方面,如果分离度下降,可以通过调节流速来增大分离度。

 

SEC色谱柱异常冲洗步骤:

1、低pH的高浓度中性盐(如0.5M硫酸钠溶液,硫酸调pH 3.0)冲洗15倍柱体积,有助于移除碱性蛋白;

2、含有机溶剂(如10%-20%的甲醇、乙腈)的缓冲盐溶液(如50mM磷酸盐缓冲液,pH 7.0)冲洗15倍柱体积,有助于冲洗掉疏水蛋白;

3、加入助溶剂有助于除去固定相上强吸附的物质(如通过氢键作用吸附等);

4、按照色谱柱测试报告的进样条件进对照品测试柱效;

 

注意:

只有在中性盐溶液和有机溶剂冲洗均没有明显改善的情况下,才建议使用助溶剂(如:6-8 mol/L 的尿素或0.2-0.3% 十二烷基硫酸钠)。

 

胶柱

硅胶柱(SiO2)在正相模式下常见的问题通常都是由于平衡不够,或未充分过渡,或含水造成的。正相色谱中水分含量是影响保留选择性的重要参数。大部分溶剂都会内含极少部分的溶解水分(如正己烷20℃下水分含量是0.0111% w/w)。正相色谱中常见的分离度、保留时间漂移等问题,可以归因于固定相和流动相中水分的变化,而填料可能还是完好的。

 

 

建议使用以下方法:

1、100%异丙醇--100%甲醇--100%异丙醇,注意异丙醇充分过渡(异丙醇粘度大,压力高,注意调整流速在合适的范围内),然后流动相平衡过夜;

2、去除固定相上的水分,用含2.5%二甲氧基丙烷,和2.5%冰醋酸的正己烷冲洗色谱柱30个柱体积;

3、使用半饱和流动相,将无水的非极性流动相分成两半,其中一半加入一定量的水,并混匀搅拌一小时,静置分层后,将水相除去,再将两部分非极性溶剂混合在一起,就配成了“半饱和流动相”(方法2和方法3 二选其一)

4、按照空进样--空白溶剂--对照品--供试品的顺序进样,看出峰情况;

 

基柱

氨基柱是常见的正相、反相均可使用的色谱柱之一。正相使用的时候氨基柱的处理维护方式同硅胶柱;

 

反相使用下,尤其是做糖类项目的时候,易出现峰展宽、拖尾、寿命等问题。首先需要明白的是,氨基柱键合的氨丙基团,本身就比常规的C18、C8等反相基团易水解,因此在使用氨基柱时,就要做好使用寿命比常规色谱柱短的心理准备(具体介绍可参考月旭公众号推文:问君能有几多愁,恰似一支氨基柱超难留。

 

 

若出现上述的问题,建议:

1、100%乙腈--100%甲醇--100%异丙醇--100%乙腈,各项冲洗40min以上(异丙醇粘度大,压力高,注意调整流速在合适的范围内);

2、按照方法1冲洗后,流动相平衡过夜,必要时需打底进样;

3、若还是无明显改善,就用纯甲醇,1.0mL/min流速,正冲3小时以上,然后流动相和溶剂、样品全部新配,再用新配的流动相平衡1小时,按照空进样--空白溶剂--对照品--供试品的顺序进样;

4、如果经过上述处理还不满足,那zui有可能是使用过程中硅胶基质破碎导致的,此时若继续冲洗费时费溶剂,且改善意义不大,建议直接采购新的色谱柱(具体可参见月旭公众号推文:乳糖检测注意事项)

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